一 、实验场景：荧光蛋白EGFP和mCherry的荧光共定位分析
1. 细胞转染是分子细胞生物学中的一项核心实验技术，其本质是将外源核酸（如质粒DNA、siRNA等）导入真核细胞内部的过程。细胞转染主要包括直接转染和病毒包装。直接转染是将质粒DNA直接导入细胞，快速简便，一般用于验证质粒的表达效果。病毒包装是将目的基因克隆到特定的病毒载体上，与质粒共转染到包装细胞，流程复杂，能够创建稳定表达荧光蛋白的细胞系，用于长期、大量的共定位研究。
图1：细胞转染流程示意图
2. 荧光共定位分析是一种重要定量评估细胞内两种不同荧光标记的分子（通常是蛋白质）在空间位置上的重合程度，从而推断它们可能存在相互作用或处于同一细胞结构的技术。
3. 在本次实验中，用户通过细胞转染技术，将编码特定荧光蛋白EGFP和mCherry的质粒DNA递送至293T细胞（人肾上皮细胞）中。细胞成功摄取质粒后，会利用自身的表达系统合成这些荧光蛋白，从而使细胞膜“带上”荧光标记。利用NCF1000激光共聚焦显微镜，主要选用60X复消色差物镜，选用405nm，488nm，561nm高功率激光波段，对不同分布，不同强弱的荧光蛋白进行共定位分析。
- 选用60X复消色差物镜，对不同蛋白标签进行荧光共定位分析
用户使用配有60X物镜（1.42 NA）的NCF1000激光共聚焦显微镜，对DAPI染的细胞核，蛋白标签EGFP和mCherry表达的细胞膜的293T细胞进行荧光共定位分析。DAPI染料选择405nm的激发波段，发射蓝光；EGFP标签选择488nm的激发波段，发射绿光；mCherry标签选择561nm的激发波段，发射红光。
图2：293T细胞3通道共聚焦图
共聚焦显微镜景深有限，难以同时清晰成像不同焦面的细胞。采用最大值投影功能，可融合各层信号，从而在一张图像中完整呈现细胞的完整形态。
图3：使用最大值投影功能前
图4：使用最大值投影功能后
三 、NCF1000共聚焦显微镜如何助力实验
1. 多色扫描
- NCF1000配合使用的NomisPro X-C软件支持多个激光通道进行扫描。
- 提供四通道同时扫描，隔通道扫描，分时扫描和自定义扫描四种扫描方式。
2. LUT色阶调节功能
- 可以根据每个通道荧光蛋白标签表达的效果进行调整，提供手动调节色阶功能和自动调节色阶功能两种方式。
图7：LUT色阶调节
3. 最大值投影功能
- 由于共聚焦的景深较小，样品细胞可能不在一个焦面上，使用最大值投影功能可以在一张图中显示蛋白标签表达的所有情况。
- 使用最大值投影功能，先要对样品进行Z序列扫描，然后在处理工具中打开Z序列图片
图8：最大值投影功能使用界面
四 、实验过程中可能遇见的问题
Q1：细胞转染时，荧光蛋白表达不够强，信号很弱，是否需要重新转染？
A1： NomisPro X-C 软件提供LUT色阶调节功能，可以通过调节信号较弱通道的色阶值，从而获得满意的成像效果。
Q2：在面临多通道荧光标记或荧光蛋白表达的情况，如何避免通道串色？
A2：为避免串色现象，可选择使用四通道分时扫描功能，但同时也会带来扫描时间长的现象。可使用隔通道扫描功能，既能保证相邻通道不串色，又能保证较快速度扫描获得图像。针对相邻通道的染色通道时，可选择自定义扫描，自定义选择扫描通道和扫描顺序。
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