一 、实验场景：烟草亚细胞定位判断目标蛋白位置
1. 亚细胞定位（Subcellular Localization）可将某种蛋白或者表达产物定位于细胞中的具体位置，如细胞核内、各种细胞器以及质膜上，从而为理解基因的作用机制提供研究方向。
图1：植物细胞结构图
2. 本氏烟草（Nicotiana benthamiana）属于茄科（Solanaceae）烟草属植植物，是异源四倍体，它的基因组由19条染色体组成。本氏烟草因其多种优势广泛应用于蛋白亚细胞定位、蛋白互作、生物医药生产等方面。如：植株较小但叶片大且茂盛，培养周期短，在实验室条件下易于种植，利于大量收集实验材料；作为模式植物，可以在植物体内完成基因表达调控及蛋白翻译后修饰，比E.coil、酵母更适合进行异源基因的功能验证；等等。
3. 本次实验中，用户主要利用农杆菌在烟草中的瞬时表达，观察黄色荧光蛋白（Yellow Fluorescent Protein ，YFP）在烟草叶片细胞中的定位。为保证观察较全面的视野和清晰的图像效果，用户选择20X物镜进行实验观察；而在激光共聚焦观察模式下，采用透射叠加荧光通道能够更准确明显地展示植物结构与荧光表达的空间关系。
实验准备材料阶段，用户将目标基因载体和农杆菌混合液注射新鲜嫩绿的烟草叶片，并在一定时间后割取叶片标记区域进行观察。
本次实验中，用户主要研究SAPK10应激活化蛋白激酶在烟草叶片细胞亚细胞结构中的位置表达。烟草叶片表面常具有一定结构，使用激光DIC通道叠加荧光通道观察可保证保留植物表面结构信息的同时观察到荧光信息表达，进而精准确认亚细胞定位信息。SAPK10应激活化蛋白激酶使用黄色荧光蛋白（Yellow Fluorescent Protein，YFP）进行标记，而在使用488nm波段进行激发后还需将图像荧光进行色彩还原。
因此，综合以上的实验要求，用户获得图像，见图3和图4。
二 、NCF1000共聚焦显微镜如何助力实验
1. 激光荧光+激光透射（DIC）
- NCF1000激光显微镜配置4个荧光通道和1个透射通道，提供实现激光荧光+激光透射（DIC）的硬件条件。
- NomisPro X-C软件中支持单独调节荧光通道与透射通道的激发光强度与增益数值，可实现同步观察通道融合效果，见图5和图6。
图5：激光通道参数设置页
图6：通道显示界面
图7：离线版本软件伪彩更改界面
2. 荧光通道更改伪彩
- NCF1000激光显微镜提供原厂NomisPro X-C软件和离线版本软件，可实现伪彩信息更改方式，见图7和图8。
- 本实验使用488nm波段进行激发，默认通道显示为绿色，可在激发信息不受影响的情况下将色彩信息改为黄色进行融合显示。
图8：NomisPro X-C软件图像获取界面更改图像伪彩设置页
三 、实验过程中可能遇见的问题
Q1：面对以烟草为代表的植物切片如何避免目标蛋白荧光假阳性表达？
A1：首先，需确定实验过程中，注射或者标记的荧光染料试剂是否正常（保质期、存放环境、浓度配比等情况）。在染剂明确未出现失误的情况下，使用NCF1000激光共聚焦显微镜激光强度≤35%，增益≤50%且激光强度数值一般不高于增益强度，若仍存在部分区域假阳性但目标蛋白标记区域表现明显，可适当调整图像色阶信息。
图9：烟叶亚细胞定位中SAPK10应激活化蛋白激酶假阳性表达
图10：经色阶调整后烟叶亚细胞定位中SAPK10应激活化蛋白激酶荧光表达
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