NCF1000 激光共聚焦显微镜

关于潜在药物抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的成像应用

一 、实验场景:潜在药物抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌实验观察

1.1 大肠杆菌和金黄色葡萄球菌

       大肠杆菌(Escherichia coli)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是两种在医学和微生物学中常见的细菌,大肠杆菌:作为革兰氏阴性菌的代表,其细胞壁结构复杂,含有外膜和脂多糖,与许多病原菌(如沙门氏菌、志贺氏菌)相似,研究其抑菌机制有助于了解针对革兰氏阴性菌的药物作用。金黄色葡萄球菌:作为革兰氏阳性菌的典型,细胞壁较厚且富含肽聚糖,与肺炎链球菌、肠球菌等具有相似性,研究其抑菌机制可为治疗革兰氏阳性菌感染提供参考。大肠杆菌和金黄色葡萄球菌因其代表性、临床相关性、实验便利性和科学研究的延续性,成为药物抑菌作用研究的经典模型菌种。通过研究这两种细菌,可深入解析抗菌药物的作用机制、耐药性产生规律及新型抗菌策略的开发,为解决全球性的抗菌药物耐药问题提供重要科学依据。

1.2 潜在药物——天然产物猪组织

      自然界中,许多动物组织含有天然抗菌成分,如抗菌肽(防御素、cathelicidins 等)、溶菌酶、乳铁蛋白、免疫球蛋白等。这些物质是宿主天然免疫的重要组成部分,对细菌、真菌甚至病毒具有直接抑制作用。已有研究表明猪组织中含有丰富的抗菌物质,猪源防御素通过破坏细菌细胞膜实现广谱抑菌猪源防御素,除此之外,HMGN2 蛋白、乳铁蛋白与溶菌酶等均被证明具有良好的抑菌作用。猪作为重要的经济动物,组织样本(如血液、脏器、分泌物等)易于从屠宰场、养殖场获取,且成本较低,对于应用场景的开发具有更高价值。

1.3 观察目的

  • 药物作用机制研究

在药物研发过程中,共聚焦显微镜可用于对观察大肠杆菌和金黄色葡萄球菌生命力状态。通过确定活细胞和死细胞的比例,从而可以用于评判潜在药物的抑菌效果。

1.4  大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的状态观察
       在本次实验中,用户使用了活细菌/死细菌双染试剂盒(SYTO 9/PI Live/Dead Bacterial Double Stain Kit),利用SYTO 9绿色核酸染料和碘化丙啶(PI)红色荧光核酸染料对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌进行活力检测,SYTO 9绿色核酸染料染色活菌,碘化丙啶(PI)红色荧光核酸染料染色死菌,见图1。采用NCF1000共聚焦显微镜,选用60X高倍复消色差物镜,配合488和561 nm波段,对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的活力进行定性观察。

图1:NCF1000拍摄的猪组织对于金黄色葡萄球菌/大肠杆菌的活力差异显示: 金黄色葡萄球菌活力显示(图A、B );大肠杆菌活力差异显示(图C、D );图像拍摄条件:NCF 1000共聚焦显微镜,60X、NA=1.42物镜,2048*2048分辨率,488、561双通道分时扫描

二 、NCF1000共聚焦显微镜如何助力实验
2.1 多点扫描
     多点扫描模式(图2),即可在一张样片上选择多个视野,在一样的条件下,包括激光强度、增益、小孔大小、分辨率等,对不同视野图像进行拍摄,加强操作的便捷性,同时进行多区域的直观对比。
     多点扫描提供两种视野选择,手动添加坐标和根据排列数和间距批量导入坐标(图3)。多点扫描记忆的坐标为视野中心坐标,包括x、y、z三方向。对于多个分散细胞,多点扫描可结合ROI裁剪,以针对于单个细胞的多点扫描。
添加完位点后,可通过双击位点坐标,平台自动移动到对应位置,以进行视野的再次确认。
图2:多点扫描设置界面

扫描模式1:常用于多区域的细胞对比观察
扫描模式2:常用于分布密集,以统计细胞数量为目的的应用

图3:多点扫描两种设置模式:手动添加坐标(图A);批量导入点位模式(图B)
2.2 细胞计数
  • NCF1000提供了计数方式(图4),为用户提供多组细胞的自动计数。用户可以在测量工作一栏中选中细胞计数工具,在图像中点击细胞即可进行计数。右键鼠标即完成一组细胞计数,并自动生成对应的细胞数。


图4:计数工具
2.3 图像亮度调节
LUT色阶调节主要功能:
1、亮度调节:通过非线性映射增强或抑制图像的明暗对比,突出目标特征。
2、去背景噪:通过调整LUT的映射曲线,压缩背景噪声的灰度范围,同时保留目标信号的细节。
*注:亮度值与去噪值比例大于等于10倍,以避免有效信号丢失。

三 、实验过程中可能遇见的问题
Q1:样本荧光强度弱,背景噪音大,如何处理?
A1:确认小孔大小,一般默认为1AU。调节激光强度和增益,可以使激光强度在20-30%区间,提高增益至40-50%区间,同时可适当拉大小孔大小。若在该条件下,图像亮度依旧弱,调节图像色阶功能,调高亮度,使样本信号增,调节去噪,去除背景噪音,使样本信号清晰。

图5 调节LUT处理图像:拍摄获得的图像(A);LUT调节亮度后的图像(B);LUT去噪后的图像(C)

Q2:图像信噪比差,无法区分噪音信号与样本信号,如何处理?
A2:关闭观察通道的激光,单独打开增益,调节增益至拍摄时强度,设置色阶LUT为自动模式,记录此时LUT值。需要拍摄的通道均需记录自动LUT下的亮度值。进行正式拍摄前,设置LUT为手动模式,将记录的LUT值分别设置在对应通道的去噪值中,以便去除放大电路本身带来的信号值,以实现去噪功能。