一 、实验场景：荧光共定位分析
1. 荧光共定位分析（Fluorescence Co-localization Analysis）是一种在荧光显微镜成像技术中广泛应用的分析方法，主要用于研究两种或多种不同生物分子（如蛋白质、核酸、细胞器等）在细胞或组织内的空间位置关系，特别是判断它们是否存在于相同的亚细胞位置（即“共定位”），以深入了解生物学过程。
核心原理
1. 荧光标记： 使用不同颜色（发射波长）的荧光探针（如荧光染料、荧光蛋白、免疫荧光抗体）特异性标记需要研究的两种或多种目标分子（A 和 B）。
2. 多通道成像：利用荧光显微镜（共聚焦显微镜最常用，因其光学切片能力可减少背景干扰）分别在对应于不同荧光探针发射波长的通道下采集图像。例如：
* 通道 1 (Ch1, 如绿色)：标记分子 A
* 通道 2 (Ch2, 如红色)：标记分子 B
3. 图像叠加与分析：将两个通道的图像叠加显示（通常使用伪彩色，如绿色和红色）。在叠加图像中：
* 显示为黄色的区域：表示 Ch1 和 Ch2 的信号在该像素位置同时存在且强度相近（绿色 + 红色 = 黄色），提示分子 A 和 B 可能共定位。
* 仅显示绿色或仅显示红色的区域：表示只有一种分子存在，没有共定位。
2. 在本次实验中，用户使用了NCF1000共聚焦显微镜，主要选用10X，20X复消色差物镜使用DIC透射配合488通道和561通道荧光多通道共同成像，利用不同荧光通道共同成像可对不同分布、不同强弱的荧光蛋白进行定性和定量分析，判断细胞形态结构和开展标记蛋白作用机制研究，以及确定目标蛋白在细胞器上的空间分布和共定位程度，同时利用透射DIC和荧光通道共同成像，可以判断荧光信号在整体组织或者细胞的相对位置。
正常情况下，荧光共定位实验采用多个通道进行拍摄观察观察。用不同通道相互组合后融合能得到不同的融合图片，对不同融合图片进行颜色上叠加观察可以得到主观定性的结论，当然也可使用处理中的共定位功能对融合图片进行客观定量的共定位信息。
拍摄条件
显微镜：NCF1000激光共聚焦显微镜
物镜： 10X（N.A.=0.45）
分辨率：2048*2048像素
激光通道：488nm，561nm、DIC通道
拍摄的DIC通道可以观察精子细胞整体的形态，利用DIC和561nm荧光通道叠加可以观察判断对应的荧光蛋白在精子细胞的位置
正常情况下，荧光共定位实验采用多个通道进行拍摄观察观察。用不同通道相互组合后融合能得到不同的融合图片，对不同融合图片进行颜色上叠加观察可以得到主观定性的结论，当然也可使用处理中的共定位功能对融合图片进行客观定量的共定位信息。
拍摄条件
显微镜：NCF1000激光共聚焦显微镜
物镜： 10X（N.A.=0.45）
分辨率：2048*2048像素
激光通道：488nm，561nm、DIC通道
三通道融合图可以通过颜色判断不同荧光蛋白在精子细胞中分布状况，例如显示为黄色代表488nm通道和561nm通道对应的荧光蛋白都有，而显示为红色代表该区域488nm荧光通道对应的荧光蛋白缺失，可能是由于细胞死亡，物质交换停止导致，具体原因需根据实际情况分析。
正常情况下，荧光共定位实验采用多个通道进行拍摄观察观察。用不同通道相互组合后融合能得到不同的融合图片，对不同融合图片进行颜色上叠加观察可以得到主观定性的结论，当然也可使用处理中的共定位功能对融合图片进行客观定量的共定位信息。
拍摄的DIC通道可以观察精子细胞整体的形态，利用DIC拍摄的特性，还可以得到有一定立体效果的图片，再利用DIC和488nm荧光通道叠加可以观察判断对应的荧光蛋白在精子细胞的位置
二 、NCF1000共聚焦显微镜如何助力实验
1. 多色扫描
- NCF1000配置的NomisPro X-C软件中支持选择多个激发通道进行扫描。
- 在多色扫描出现串色现象时，可选择四通道分时扫描、双通道同时/分时扫描、自定义扫描三种扫描方式避免相邻通道被同时激发的情况。
2. LUT色阶调节功能
- 可根据每个通道染色情况和荧光强度要求进行调整，提供手动调整色阶和自动调节色阶两种方式。
3. 共定位分析功能
- 定性分析：选定区域进行Plot Profile获取灰度值变化趋势。根据图9可初步了解488通道标记蛋白与561通道标记蛋白存在共定位情况。
图6:灰度值趋势变化图
二 、NCF1000共聚焦显微镜如何助力实验
①使用Colocalization Finder等插件进行定量分析，生成共定位散点图(见图7[a])，并根据散点图的分布判定共定位关系。越接近对角线，共定位程度越好，反之，则共定位程度越差。
②获取定量数据进一步量化共定位分析结果。例如通过Pearson’s coefficient相关系数（PCC）、Manders overlap coeficient重叠系数（MOC）、重叠系数K1和K2、共定位系数M1和M2（MCC）等。
三 、实验过程中可能遇见的问题
Q1：使用DIC拍摄时需注意哪些配置？
①由于本实验设备为电动DIC机型，弯臂上方装置可以自动控制，若非电动DIC机型，需注意把DIC拉杆推入光路，否则共聚焦DIC无法正常成像。
②由于激光本身是线偏光，因此激光DIC成像时，应该把起偏器拔出光路，或者将起偏器打空。
③DIC成像时，检偏器应该在光路中，聚光镜转盘应该转到对应物镜的DIC镜片位置，否则将会影响DIC成像效果
④DIC成像时，由于DIC成像光路短，实际需要的激光强度比较低，如果需要同时拍摄成像，应额外注意DIC通道激光增益的强度。
⑤本实验设备为5探测器机型，DIC配备了单独的探测器，因此若需要可以五路同时成像，其他机型640nm通道和DIC通道共用一个探测器，无法同时成像
Q2：样品暂未封片，可否在NCF1000共聚焦显微镜上进行正放观察？
不推荐使用。NCF1000采用倒置荧光显微镜主机，需使用0.17mm的盖玻片进行封片，并倒放样品观察，以获取合适、清晰的图像数据。
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