一 、实验场景：淋巴癌细胞观察
1.1 淋巴癌细胞Pferiffer
淋巴癌（淋巴瘤）是一类起源于淋巴系统的恶性肿瘤，具有高度异质性和复杂性。深入研究淋巴癌细胞的生物学特性，对于基础医学、临床治疗及公共卫生均具有不可替代的重要性。Pfeiffer细胞属于弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）中的一种亚型，其分子特征与经典型DLBCL存在差异。靶向治疗通过针对Pfeiffer细胞特有的分子标志物（如特定基因突变或蛋白表达异常）设计药物，可实现精准打击，减少对正常细胞的损伤，提高治疗效果。
图1 Pfeiffer:人弥漫性大细胞淋巴瘤B淋巴复苏细胞
1.2 共聚焦显微镜在淋巴癌细胞Pferiffer上的的应用
亚细胞结构观察：共聚焦显微镜的分辨率远超传统光学显微镜，可清晰观察Pfeiffer细胞的细胞核、线粒体、内质网等亚细胞结构。例如，通过荧光标记技术，可精准定位细胞核内的DNA或RNA分布，揭示淋巴瘤细胞的遗传物质异常。
三维重建：通过逐层扫描样本并叠加光学切片，共聚焦显微镜可重建Pfeiffer细胞的三维结构，直观展示细胞形态和空间分布，有助于理解肿瘤细胞的异质性和生长模式。
利用荧光探针（如抗体、核酸染料）对Pfeiffer细胞中的特定分子（如肿瘤相关抗原、信号通路蛋白）进行标记，通过共聚焦显微镜实现检测。
药物作用机制：共聚焦显微镜可用于观察药物对Pfeiffer细胞的作用机制，如药物诱导的细胞凋亡、自噬等。例如，通过观察药物处理后Pfeiffer细胞内线粒体膜电位的变化，评估药物的促凋亡作用。
1.3 观察目的
为了探索淋巴瘤的发病机制及靶向治疗方案，用户以HMGA2和CDCA8为研究对象，拟在共聚焦显微镜下观察敲除该基因后的蛋白荧光强度的变化。
1.4 淋巴癌细胞拍摄
在本次实验中，用户使用了DAPI可视化细胞核，分别以HMGA2和CDCA8抗体作为HMGA2和CDCA8的特异性一抗，以兔抗和Santa cruz鼠抗分别作为HMGA2和CDA8的二抗进行标记。通过NCF1000共聚焦显微镜，配合100X，1.49高倍复消色差物镜，405，488和561 nm波段，对Pfeiffer细胞进行观察（图2 A-D）。
2.1 图像中心寻址
图像中心寻址可用于快速将目标移至视野中心。在小手选中的状态下，双击目标，该目标即可移至视野中心，如下图所示
图3 图像中心寻址功能：双击目标物（A）；目标物 移动至视野中心（B）
2.2 多点扫描
多点扫描模式，即可在一张样片上选择多个视野，在一样的实验条件下，包括激光强度、增益、小孔大小、分辨率等，对不同视野图像进行拍摄，加强操作的便捷性，同时进行多区域的直观对比。
多点扫描提供两种视野选择，自定义设置点位和自动点位添加。多点扫描记忆的坐标为视野中心坐标，包括x、y、z三方向。对于多个分散细胞，多点扫描可结合ROI裁剪，以针对于单个细胞的多点扫描。添加完位点后，可通过双击位点坐标，平台自动移动到对应位置，以进行视野的再次确认。
图4 多点扫描界面及图像查看： 多点扫描模式（A）；图像播放查看不同点位目标物（B）
2.3 图像参数应用
对于不同的样片，但是需要在同一个条件下进行拍摄观察的图像，可以采用复用图像参数的方式保持实验条件的统一。首先明确需要复用参数的图像，选择该图像后，右键鼠标，点击“应用图像参数”（图6），则会将该图片的通道、小孔、位置、激光、增益等参数重新应用于软、硬件中。
图6 图像参数应用操作
Q1: 捕获的多组图如何快速导出？
A2：在捕获文件夹下，选择需要导出的几组文件，右键鼠标，选择图像批量导出按钮，自定义文件存储位置和名称，点出导出即可。每一个图片文件均会导出对应的文件夹，导出图像包括各通道及融合通道图像。
Q2：样品细胞少，在高倍物镜下，共焦模式中，难以找到目标物，如何快速找像？
A3：宽场模式快速找像。在软件中选择宽场模式，宽场模式具有大视野，此时更能快速找到目标物，找到目标物后，软件切换至共焦模式，确认光路在左，荧光模块在空，进行共焦拍摄。
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